System lab-on-a-chip integrujący przygotowanie próbek tkanek i multipleks RT-qPCR do analizy ekspresji genów w ocenie hepatotoksyczności w miejscu opieki

Prawdziwie praktyczny system lab-on-a-chip (LOC) do oceny hepatotoksyczności w punktach opieki (POCT) wymaga ucieleśnienia pełnej automatyzacji, łatwości użycia i diagnostyki typu „próbka w odpowiedzi” możliwości. Do tej pory zgłoszone mikroprzepływowe urządzenia do oceny hepatotoksyczności POCT pozostają szczątkowe, ponieważ w dużej mierze zawierają tylko półilościowe lub pojedyncze możliwości wykrywania próbki/genu. W tym artykule po raz pierwszy opisujemy zintegrowany system LOC, który jest nieco zbliżony do praktycznego urządzenia do oceny hepatotoksyczności POCT – obejmuje zarówno przygotowanie próbki tkanek, jak i multipleksową RT-PCR w czasie rzeczywistym. Charakteryzuje się półautomatyką, jest stosunkowo łatwy w użyciu i ma możliwości „próbki na odpowiedź” do analizy multipleksowej ekspresji genów.

Nasz moduł do przygotowywania próbek tkanek, zawierający zarówno mikrohomogenizator , jak i obrabiane powierzchniowo mikrokulki paramagnetyczne, pozwolił uzyskać ekstrakty mRNA o wysokiej czystości, znacznie lepsze niż ręczne metody ekstrakcji. Procedura wstępnego ładowania podkładu i pojedynczego wlotu w naszym multipleksowym module RT-PCR w czasie rzeczywistym upraszczają procedury obsługi poza chipem, zapewniając łatwość użytkowania. Aby zademonstrować skuteczność naszego systemu LOC do oceny hepatotoksyczności POCT, przeprowadzamy przedkliniczne badanie na zwierzętach z podaniem cyklofosfamidu, a następnie przeprowadzamy analizę ekspresji genów dwóch kluczowych biomarkerów białkowych w testach czynności wątroby, transaminazę asparaginianową (AST) i transaminazę alaninową (ALT ).

Nasze wyniki eksperymentalne przedstawiają znormalizowane zmiany krotności 1,62 i 1,31 odpowiednio dla AST i ALT, ilustrując regulację w górę ich poziomów ekspresji, a zatem potwierdzając ich selekcję jako krytycznych genów będących przedmiotem zainteresowania. W skrócie, ilustrujemy wykonalność analizy multipleksowej ekspresji genów w zintegrowanym systemie LOC jako skutecznych środków POCT do oceny hepatotoksyczności.

Jednoetapowa ekstrakcja RNA z różnych mezenchymalnych komórek macierzystych osadzonych w hydrożelu w celu ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją

W wielu zastosowaniach inżynierii tkankowej komórki takie jak ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) muszą być osadzone w hydrożelach. Analiza osadzonych hMSC wymaga ekstrakcji RNA, ale typowe procedury ekstrakcji często dają niską wydajność i/lub niską jakość RNA. Systematycznie badaliśmy cztery metody homogenizacji w połączeniu z ośmioma protokołami ekstrakcji RNA dla hMSC osadzonych w trzech powszechnych typach hydrożeli (alginat, agaroza i żelatyna). Dla wszystkich trzech typów hydrożeli stwierdziliśmy, że przy użyciu ciekłego azotu lub rotora-statora uzyskano niską wydajność RNA, podczas gdy przy użyciu mikrohomogenizatora lub enzymatycznego/chemicznego trawienia hydrożeli uzyskano lepsze wydajności, niezależnie od tego, który protokół ekstrakcji został następnie zastosowany.

Protokół ekstrakcji gorącym fenolem generalnie osiągnął najwyższe wartości A260 (reprezentujące do 40,8 μg RNA na 10 (6) komórek), ale metoda bromku cetylotrimetyloamoniowego (CTAB) dała RNA o lepszej jakości, ze stosunkami A260/A280 i A260/A230 oraz Widma UV podobne do kontroli czystego RNA.

RNA wytworzony tą metodą nadawał się również jako matryca do punktu końcowego i ilościowej odwrotnej transkrypcji-PCR (qRT-PCR), osiągając niskie wartości Ct ~20. Rozważny wybór metod homogenizacji hydrożelu i ekstrakcji RNA może zapewnić przygotowanie wysokiej jakości RNA, które generuje wiarygodne dane punktu końcowego i ilościowe dane RT-PCR. Dlatego proponujemy uniwersalną metodę, która jest odpowiednia do ekstrakcji RNA z komórek osadzonych we wszystkich trzech typach hydrożeli powszechnie stosowanych w inżynierii tkankowej.

Wprowadzanie leków rozpuszczalnych w wodzie do mikrosfer PLGA

Mikrosfery poli(laktydowo-ko-glikolidowe) (PLGA) zawierające niebieski dekstran, jako model leków rozpuszczalnych w wodzie, przygotowano z emulsji w(1)/o/w(2) przy użyciu mikrohomogenizatora i metody odparowania rozpuszczalnika. Wpływ warunków przygotowania, takich jak stężenie poli(alkoholu winylowego) (PVA) w fazie w(2), lepkość wewnętrznej rozpuszczalnej fazy wodnej, stosunek objętości fazy olejowej do fazy w(1) w emulsji pierwotnej, stężenie PLGA w fazę olejową oraz masę cząsteczkową lub skład PLGA, na podstawie właściwości mikrosfer PLGA zawierających rozpuszczalne w wodzie leki.

Stężenie poli(alkoholu winylowego) (PVA), dyspergatora rozpuszczonego w fazie w(2) emulsji wtórnej, nie wykazywało żadnego wpływu na końcową wielkość cząstek. Z drugiej strony, stosunek objętości fazy olejowej do wody w emulsji pierwotnej wpływał na końcową wielkość cząstek, co wydawało się być związane z lokalnym stężeniem PLGA w emulsjach w(1)/o. Oznacza to, że wielkość cząstek wzrastała wraz ze wzrostem stosunku objętości fazy w(1) do fazy olejowej, w(1)/o (v/v).

Na efektywność ładowania nie wpływał jednak stosunek objętości w(1)/o (v/v), ale stężenie niebieskiego dekstranu w fazie w(1). Wyższą wydajność ładowania zaobserwowano w mikrosferach PLGA przygotowanych z fazy w(1) zawierającej niższe stężenie niebieskiego dekstranu. Roztwór niebieskiego dekstranu (wewnętrzna faza wodna) o mniejszej lepkości może skutkować niższym współczynnikiem wycieku niebieskiego dekstranu podczas procedury przygotowania. Wzrost stężenia i masy cząsteczkowej PLGA spowodował wzrost wielkości cząstek.

Lipaza lipoproteinowa tkanki sutkowej kozy: porównanie metod ekstrakcji

Lipazę lipoproteinową gruczołu mlekowego u kóz w okresie laktacji wyekstrahowano 3 metodami: homogenizacja tkankowych proszków acetonowo-eterowych; homogenizacja wodna surowej tkanki przy użyciu aparatu Ultra-Turrax; wodna homogenizacja surowej tkanki przy użyciu mikrohomogenizatora Sorvall Omni-mixer. Chociaż istniały różnice między wartościami bezwzględnymi uzyskanymi trzema metodami, każdy typ homogenatu wykazywał aktywność lipolityczną o charakterystyce lipazy lipoproteinowej (tj. ponad 90% hamowania przez pominięcie surowicy lub dodanie NaCl). Ponadto te 3 metody były silnie skorelowane i wykazywały podobne różnice w okresie laktacji, równolegle z wydzielaniem długołańcuchowych kwasów tłuszczowych do mleka. Powtarzalność pomiaru aktywności lipolitycznych homogenatu wynosiła około 8%, podczas gdy z dnia na dzień powtarzalność ekstrakcji enzymu i oznaczenia wynosiła około 20% dla każdej metody.

Tomografia mikrokomputerowa skał piaskowcowych: zbiory danych surowych, filtrowanych i segmentowanych

Mikrotomografia komputerowa o wysokiej rozdzielczości jest ważną dziedziną nauki, która dobrze koreluje z kilkoma metodologiami eksperymentalnymi i służy jako podstawa zaawansowanych badań z zakresu fizyki obliczeniowej, w których obrazy o wysokiej rozdzielczości są wykorzystywane jako dane wejściowe do różnych modeli symulacji naukowych. Przedstawiony tu zestaw danych obejmuje (surowe) obrazy w skali szarości uzyskane przy użyciu tomografu rentgenowskiego Bruker Skyscan 1272; przefiltrowane obrazy uzyskane za pomocą filtrów wzmacniających kontrast i redukujących szumy; oraz obrazy segmentowane uzyskane przy użyciu metody segmentacji IsoData. Wszystkie obrazy mają rozdzielczość 2,25 µm (woksele izometryczne) i rozmiar 1000 ³ wokseli.

Wewnątrztorebkowa mikroenukleacja bolesnego nerwiaka nerwu strzałkowego powierzchownego u 60-letniego mężczyzny: rzadkie spotkanie

TŁO Schwannoma są najczęstszymi łagodnymi nowotworami osłonek nerwów obwodowych, zlokalizowanymi głównie w nerwach czaszkowych i kończyn górnych. Ich występowanie w kończynach dolnych jest rzadkie, a specyficzne zajęcie nerwu strzałkowego powierzchownego jest niezwykle rzadkie. Przedstawiamy przypadek bolesnego nerwiaka nerwu strzałkowego powierzchownego prawego, który został wycięty techniką wewnątrztorebkowej mikroenukleacji. OPIS PRZYPADKU 60-letni mężczyzna z Azji Południowej, który od 2 lat cierpi na bolesny guzek na bocznej powierzchni prawej górnej części nogi. W badaniu klinicznym stwierdzono zwartą masę zlokalizowaną w proksymalnej bocznej części prawej nogi o wymiarach około 3×2,5 cm. Na masie obecna była silna tkliwość. Test Tinela był pozytywny. Nie stwierdzono deficytów czuciowych ani motorycznych ani neurofibromatozy w wywiadzie.

Biomasher II Disposable Micro Tissue Homogenizer (Non-sterile)
25534-100	Polysciences Europe GmbH	1pack	261.36 EUR
BioMasher III Disposable Micro Tissue Homogenizer (Non-sterile)
25535-50	Polysciences Europe GmbH	1pack	199.8 EUR
Biomasher II® Disposable Micro Tissue Homogenizer (EOG-sterilized)
25533-100	Polysciences Europe GmbH	1pack	301.32 EUR
Microtube homogenizer, 115V
BCM1200	Bio Basic	1 pcs, 1 UNIT	11944.61 EUR
Microtube homogenizer, 115V
BCM1201	Bio Basic	1 pcs, 1 UNIT	1224.14 EUR
BeadBug™ Microtube homogenizer, 115V
D1030	Benchmark Scientific	1 each	1000.42 EUR
BeadBug™ Microtube homogenizer, 230V
D1030-E	Benchmark Scientific	1 PC	1000.42 EUR
BeadBug Microtube homogenizer - EACH
SLS1402	Scientific Laboratory Supplies	EACH	1629.45 EUR
BeadBlaster™ Microtube homogenizer, 115V
D2400	Benchmark Scientific	1 each	9460.6 EUR
BeadBlaster™ Microtube homogenizer, 230V
D2400-E	Benchmark Scientific	1 PC	9460.6 EUR
BeadBlaster Microtube homogenizer 230V - EACH
HOM3012	Scientific Laboratory Supplies	EACH	13678.2 EUR
G9a Homogeneous Assay Kit
52051	BPS Bioscience	384 rxns.	1125 EUR
P300 Homogeneous Assay Kit
50078	BPS Bioscience	384 rxns.	1135 EUR
EZH2 Homogeneous Assay Kit
52059	BPS Bioscience	384 rxns.	3100 EUR
LSD1 Homogeneous Assay Kit
GWB-PS768A	GenWay Biotech	384reactions	Ask for price
BeadBlaster™ 24 Refrigerated Microtube Homogenizer, 115V
D2400-R	Benchmark Scientific	1 each	15098.14 EUR

Obrazowanie wykazało cechy sugerujące schwannoma. Wskazano na operację; Wykonano wewnątrztorebkową mikroenukleację. Ocena histopatologiczna guza wykazała wzorce Antoniego A i B z palisadą jądrową i ciałkami Verocay, cechami nerwiaka osłonkowego. Okres pooperacyjny przebiegł bez zakłóceń ; nie stwierdzono deficytów neurologicznych.

WNIOSKI Opisany przypadek uznano za rzadki, brak danych dotyczących epidemiologii choroby w piśmiennictwie. Zapewniamy krótki przegląd i dodajemy kluczowe dane do literatury. Mimo jego rzadkości należy zachować świadomość tego stanu i uwzględnić go w diagnostyce różnicowej nieurazowego bólu nóg. Opierając się na naszym doświadczeniu, potwierdzeniu z poprzednich opisów przypadków i satysfakcjonującym wyniku naszego przypadku, zalecamy stosowanie wewnątrztorebkowej techniki mikroenukleacji, jeśli to możliwe, w przypadku nerwiaków osłonkowych.